発表のポイント

• レプトスピラ症を引き起こす細菌、レプトスピラは、川のレジャーなどで皮膚や粘膜から血流に入り、標的臓器へと広がりますが、そのメカニズムは不明でした。
• 感染が起こる臓器では、隣り合う細胞どうしが「細胞をシールする装置」によって密着することで臓器の構造と感染阻止を含む生理機能が維持されています。
• 本研究グループは、感染が起こるときに、レプトスピラが細胞をシールする装置を壊すことを明らかにし、さらにその破壊を阻止することに成功しました。
• レプトスピラによる臓器破壊の仕組みを解明したことから、新規治療薬開発への応用が期待できます。

細胞に付着するレプトスピラ. 当該論文Sebastián et al., Cellular Microbiology, 2021より改編

研究の背景

レプトスピラ症は熱帯・亜熱帯地域に多く見られる人獣共通感染症の一種です。感染症法で届出対象とされていますが、その臨床症状には発熱や筋肉痛など軽症型から黄疸・出血症状・多臓器不全などを伴う重症型まで多様性があるため、確定診断が難しい感染症として知られています。初診が遅れ重症化すると死に至ることもあります。沖縄県での患者発生は他県に比べ多く（届出件数の半数が沖縄）、河川でのレジャーによる集団感染の報告も多数あります。レプトスピラ症の治療としては抗菌薬による早期治療が効果的ですが、抗菌薬の投与による副作用などが問題となっており、新たな治療法の開発が求められています。

レプトスピラ症の原因細菌であるレプトスピラは、皮膚・粘膜から血流に入り、肺や腎臓などの標的臓器へと拡がります。一方、皮膚や臓器にはもともと細胞間接着装置（接着装置）があり、隣り合う細胞どうしを密着させることで、臓器の構造と感染阻止を含む生理機能を維持しています。接着装置は、カドヘリン^（1）を中心分子とする接着帯と閉鎖帯から構成されています。さらに、閉鎖帯は、細胞膜に存在するタンパク質（オクルディン）と細胞内裏打ちタンパク質などから構成されています。病原細菌は様々な戦術を駆使して、これらのタンパク質の機能を撹乱し、感染を成立させます。レプトスピラの場合は、細胞間隙を通過しながら肝臓・肺・腎臓などの標的臓器にたどり着くことが動物感染モデルを用いた研究で示唆されていましたが、その仕組みは未解明のままでした。

研究成果の概要

レプトスピラがどのように標的臓器に辿り着くかを理解することは、レプトスピラ症の重症化と本菌の全身への広がりを遮断するために重要です。そこで、我々は、近位尿細管上皮細胞^（2）（renal proximal tubular cells, RPTEC）を安定した経上皮抵抗^（3）値を示す細胞として分化させた実験系を立ち上げました。この実験系を用いて、レプトスピラを基底側から感染させ、FIB-SEMトモグラフィ法^（4）にて感染の現場をスナップショットで捉えることに成功し、感染24時間後には多数のレプトスピラが細胞間隙に存在することがわかりました(図1、図2)。さらに、レプトスピラの動態を理解するために、継時的にビデオ顕微鏡によるモニタリングや上皮細胞の構造と抵抗値などを解析しました。その結果、レプトスピラの細胞への付着上昇に伴い、抵抗値が低下することが分かりました（図2）。

図1．レプトスピラによる近位尿細管上皮細胞の感染戦略の解析。 近位尿細管上皮細胞（RPTEC）はTranswell^（5）にて培養し、基底側からレプトスピラで感染させた。継時的にRPTECのバリア機能、レプトスピラの運動性・局在と細胞間接着装置の構造を解析した。当該論文Sebastián et al., Cellular Microbiology, 2021より改編。

また、低い抵抗値を示す細胞では、カドヘリンとオクルディンの膜タンパク質の局在の著しい変化が誘導されました。これらの結果により、レプトスピラは接着装置を破壊し、細胞間隙を通過しながら上皮細胞の頂端側へと移行することが明らかになりました。

図2．レプトスピラは細胞間隙の細胞膜に強固に付着し、経上皮抵抗値の減少を誘導する。(a)感染24時間後のFIB-SEM トモグラフィ法でモデリングした像。白いアローヘッドは細胞間隙に局在するレプトスピラを示す。隣同士の細胞をそれぞれ人工的に赤と青にしている。(b）感染細胞と非感染細胞の経上皮抵抗値の変化を示す。感染24時間後には感染細胞の経上皮抵抗値は優位に減少した(**P < 0.01)。当該論文Sebastián et al., Cellular Microbiology, 2021, より改編。

次に、レプトスピラの接着装置破壊機構を明らかにするために、様々の阻害を用いた感染実験を行いました。その中で、カドヘリンの細胞内取り込みを阻害するPitstop2^（6）を用いた感染実験では、レプトスピラによる接着装置の破壊と（図3）、レプトスピラの頂端側への移行を阻止することができました。この結果から、レプトスピラによる細胞間接着装置の破壊は、その接着に重要な細胞外領域をもつカドヘリンを細胞内に取り込むことで引き起こされることがわかりました（図4）。

図3. 阻害剤（Pitstop2）で処理した細胞と非処理細胞をレプトスピラで感染させ、感染24時間後に蛍光免疫染色を行った。カドヘリンは緑、オクルディンは赤、細胞の核は青で染めている。レプトスピラは細胞間接着装置を破壊するためカドヘリンとオクルディンの細胞膜局在が低下するが、Pitstop2は細胞間接着装置の破壊が阻止した。当該論文Sebastián et al., Cellular Microbiology, 2021, より改編。

図4．レプトスピラによる細胞間接着装置破壊の課程：
① 基底膜側の細胞膜へ付着 ② 細胞表面で運動 ③ カドヘリンの細胞内取り込みの誘導 ④ オクルディンの局在変化 ⑤ 細胞間接着装置の破壊
当該論文Sebastián et al., Cellular Microbiology, 2021より改編。

研究成果の意義

体内に侵入したレプトスピラは、コルク栓抜きのような形状で運動しながら組織内を移動すると考えられています。レプトスピラは、発熱後7日間程度血液中に存在しますが、10日前後でレプトスピラに対する抗体が産生されるため菌は排除されます。しかしながら、菌は腎臓の近位尿細管に留まって長期にわたり尿中へと排出されます。これまでは菌がどのように全身へと移行するかが理解されていませんでした。

本研究で用いた実験系では、動物感染モデルと同様、レプトスピラが細胞間隙を移動することを初めてin vitro^（7）で再現できたことによって、レプトスピラがカドヘリンの細胞内取り込みを誘導し、細胞間接着装置を破壊することが明らかになりました。従って、カドヘリンの細胞内取り込みを阻害することによってレプトスピラの全身への広がりを食い止められることが示唆されました。本研究で得られた新規知見は、レプトスピラ症の病態形成メカニズムの理解に寄与し、新たな制御法の開発につながることが期待できます。

用語解説